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诺如病毒的实验室诊断

发布时间:2015-12-25 10:21:29   发布人:微检科   阅读数:3399   来源:

诺如病毒感染性腹泻(急性胃肠炎)是由诺如病毒引起的急性肠道传染病。已有的研究和数据表明诺如病毒是引起腹泻暴发疫情的最主要病原。诺如病毒抵抗力和传染性均较强,10-100个病毒粒子就会使人感染。诺如病毒可随病人的粪便、呕吐物排出造成环境污染,在外环境,如物体表面、污水、垃圾、地表水、食物中可存活较长时间(数天至数周) 其实验室诊断流程如下:

1. 标本采集

粪便标本应在发病首日采集,至多不能超过发病急性期(48~72h),此时为稀、软便,病毒排出量最多。一次流行,至少采集10例患者粪便,每份标本量约1~5ml,成形便和肛拭子诊断意义很小。标本置4℃可存放2~3周,运送也要低温条件。病人呕吐物是粪便标本的最佳补充,有助于病原的诊断。该标本的采集、储存和运送条件同于粪便。从流行病学角度出发,在水、食物或其它外环境标本中检出NV意义重要。需注意检测技术要锁定在高度怀疑的传播媒介上,尽早采样并置4℃存放,若是饮用水,需用大容量(5~100L)浓集病毒后检测。

2. 实验室检查

2.1电镜法 直接电镜法(EM)和免疫电镜法(IEM),EM 法观察的灵敏度较低,要求每毫升粪便样品中至少有大约 106个病毒粒子,因此只能用于患病早期病毒大量排出时采集的样本检测。IEM 法比 EM 法的敏感性可提高 100 倍,主要应用患者恢复期血清捕捉同型抗原,从而增加检出率。电镜法的缺陷在于设备昂贵,不能广泛普及;检测结果与操作者的技能和经验有直接关系;灵敏度相对较低;不适于大规模流行病学调查。

2.2免疫法 包括放射免疫法(RIA)、生物素-亲和素免疫法(Biotin-Avidin Immunoassy)和酶联免疫法(ELISA)。RIA法的灵敏度比IEM 法可 提高10~100倍,可以检测出抗体升高的水平,为流行病学提供更有参考价值的资料。RIA 法的不足之处在于它需要 6 d,且需要放射性同位素标记。为了简化方法,美国疾病预防控制中心建立了生物素-亲和素免疫法,其灵敏度与 RIA 法相当,目前该方法已成为美国疾病预防控制中心检测NLV抗原和抗体的标准实验方法之一。1992年Jiang 等重组杆状病毒表达NV衣壳蛋白成功后,建立起的 NV 酶联免疫检测方法快速、灵敏、经济,其不足之处是免疫反应的株型特异性太强,所以应用范围还比较窄。酶链免疫法特异性强,灵敏度高,诊断迅速,且较经济,是目前可广泛应用的检测方法。由于NLV培养还未成功,原来用作试剂的病毒抗原数量受到限制,现在,用分子生物学技术已经可以人工重组NV的衣壳蛋白,从而解决了上述问题。

2.3分子生物学检测方法

杂交技术和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)除了能更准确、灵敏地检测标本中的NV,尤其是低浓度的NV感染外,最大的优点在于可以进一步对病毒进行基因型的研究,不会受到获得分型单克隆抗体的限制,对流行病学研究具有重要意义。

等温核酸扩增法 (NASBA)直接扩增RNA 来检测 NV,样品中病原RNA得到指数级扩增,产物通过琼脂糖凝胶电泳或斑点印迹杂交鉴定结果。该方法的灵敏度略低于 RT-PCR 法;整个过程只有一步RNA扩增,避免了RT-PCR存在的RNA交叉污染;缩短了操作时间;假阳性率低。