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人感染高致病性禽流感的实验室诊断方法

发布时间:2015-12-25 09:49:59   发布人:微检科   阅读数:3309   来源:

(1)病毒分离:采取喉头、气管、肺、气囊、肝、脾、脑及直肠内容物等,置于加有青霉素10000单位/毫升,链霉素10000单位/毫升组织培养液或50%葡萄糖磷酸盐缓冲液中4℃保存或运输,不超过48小时。用上述溶液将病料制成10%乳剂-70℃保存或3000转/分离心5分钟,取上清液用0.2~0.45微米(220~450纳米)的滤膜过滤除菌,取滤液0.3毫升,尿囊腔接种9~11日龄SPF鸡胚,每份样品至少接种5个鸡胚。经37℃孵化4天(剔除接种后24小时内死亡鸡胚),置于4℃ 6~12小时杀死鸡胚,吸取尿囊液,同时采取绒毛尿囊膜。尿囊液中若含有AIV时,HA试验呈阳性。若初代尿囊液HA试验呈阴性,需再传一代,取尿囊液1:10稀释接种0.3毫升/胚,再呈阴性则判断为AIV感染阴性反应;若呈阳性,用ND抗血清进行HI试验,若呈阴性反应时再结合以下血清学诊断可初步判定为AIV感染。

(2)血清学诊断:利用AGP、ELISA方法可检测A型流感病毒共有的特异性抗体或抗原,已鉴定的标准AIV制备的抗原可用检测可疑鸡群的血清抗体(此步骤可在病毒分离前进行)。将上述病毒分离时采用的鸡胚尿囊膜用PBS(pH=7.2)洗净,排尽囊中液体,研磨乳剂,反复冻融3次,3000转/分,离心10分钟,取上清液,用终浓度0.1%的福尔马林经37℃36小时灭活,即可用作AGP抗原(3个膜可制做约1毫升抗原)。用已知的标准抗血清与其进行AGP试验,鉴定分离病毒。

(3)病毒定型及定性:(H和N亚型):确定亚型需用已定型(H1~H5,N1~N9)的一系列单特异性抗血清做HI试验,因此应交专门机构进行。

(4)致病性(毒力)的测定:HPAIV的判定标准(美国家畜卫生协会)。
①取1:10稀释的感染尿囊液0.2毫升静脉接种8只4~8周龄SPF鸡,隔离饲养10天内死亡6只或6只以上(致死率75%以上)。
②致死率1~5/8(75%以下),H5或H7亚型以外的病毒,在不加胰蛋白酶细胞培养中可增殖,并可形成CPE或蚀斑。
此外,也可测定ICPI(脑内接种致死指数)来判定致病性,出雏40小时SPF初生雏10只,脑内接种10个病毒,7天内观察记录死亡情况,测定ICPI值,在1.5~2.0者可判定为HPAIV。
(5)基因诊断:利用基因扩增(PCR)方法直接检出病毒的基因,此方法较常规的病毒分离法速度快,特异性高,而且可克服因野外取料混有其他病毒造成的误诊。
一旦经病毒分离、血清学试验初步诊断为AI时,应立即报告国家有关兽医机构,并将分离的病毒或采集的病料报国家指定的机构进行确诊和定位。诊断过程中应严格执行防污染、防扩散的操作程序。

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